一步法qPCR试剂 One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix
One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix说明书
I. 试剂盒货号
| 货号： | 产品名称 |
| RTQ102 | One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix, 200x20ul reactions (0.8ml) |
| RTQ108 | One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix, 800x20ul reactions (3.2ml) |
II. 试剂盒原理
One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix包含M-MLV反转录酶、热启动Taq DNA Polymerase 、dNTP、 Mg2 、RNAse Ihibitor、SYBR Green荧光染料、Buffer等.采用独特的体系，使逆转录和qPCR两种反应在同一管中进行，只需要加入RNA或DNA模板、特异性引物和 RNase-Free ddH2O 即可使 RT 和 Real Time PCR 反应有效的结合起来，快速的完成基因的定量检测。
1. 该产品具有很强的耐受性，高特 异性和稳定性。扩增效率高、特异性扩增能力强、错配率低等优点。
2. 简化实验操作程序，快速、高效的对RNA或DNA模板进行检测。
3. 减少非特异性扩增，提高 PCR 的准确性。u
4. 有效提高反应的扩增效率和特异性。 u
5. 更高的检测灵敏性，更强的热稳定性，更好的耐受性。
6. 试剂冻存不结冰，避免反复冻融，即用即取。
III. 注意事项
1. 使用前混匀；
2. 试剂具有一定粘性，吸取前请先润湿枪头；
3. 在上机前所有组份加样完成后，请务必震荡混匀或枪头吹匀反应体系；
4. 试剂盒-20℃避光保存。
IV. 实验步骤
1. 混匀试剂盒中的PCR Mix。短暂离心使管中试剂集中于底部，冰上保存。
2. 按照下表内容，在冰上准备 PCR反应液。
| 试剂 | 20μl体系（其他体系按比例调整） | 终浓度 |
| One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix | 4μl | 1× |
| PCR Forward Primer（10μM） | 0.4μl~0.5μl | 0.2~0.25μM |
| PCR Reverse Primer（10μM） | 0.4μl~0.5μl | 0.2~0.25μM |
| RNA OR DNA template | 1ng~1000ng | 0.05~50 ng /μl |
| ddH2O | 补水至20μl |
3. PCR反应条件
| step 1 | 反转录 | 48℃ | 5-15 min | 视实际效果而定 |
| step 2 | 预变性 | 95 ℃ | 3 min | |
| PCR 扩增 | 95 ℃ | 12 s | 40 cycles | |
| 58℃ | 30 s（read） | |||
| step 3 | 溶解曲线 |
应用ABI 7300/7500 和StepOnePlus 两步法 PCR 扩增标准程序：
Stage 1： 1个循环 48℃，5-15分钟，时间视实际效果而定
Stage 2： 1个循环预变性 95℃ 3 分钟，
40个循环 95℃/12秒 58℃/30秒
Stage 3： Melt Curve
实验结果分析：确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线等。
应用 CFX96™两步法 PCR 扩增标准程序：
Step 1：1个循环 48℃，5-15分钟，时间视实际效果而定
Step 2：1个循环 预变性 95℃ 3 分钟
39个循环（实际扩增有40 个循环） 95℃ 12 秒 58℃ 30 秒
Step 3：Melt Curve
实验结果分析：确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线等。
注意：
1. 逆转录时间可根据实验需要进行调整，一般的内源基因如 β-Actin，只需要 5 分钟即可；检测特异的表达基因，可以根据需要适当延长逆转录时间到15分钟。
2. PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异。在具体操作中，需要根据目的片段大小、扩增片段的碱 基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况来设计最佳的反应条件，包括退火温度，延伸时间等。