RNA提取试剂盒（磁珠法）

RNA提取试剂盒（磁珠法）

本试剂盒采用具有独特分离作用的磁珠和缓冲液系统，从样品中分离纯化高质量RNA，特殊包被的磁珠，在一定条件下对目的RNA具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的RNA，能够达到快速分离纯化RNA的目的。整个过程不涉及有毒试剂，安全、便捷、提取的RNA纯度高。使用本试剂盒纯化的RNA在A260/A280的紫外吸收均在1.8~2.0之间，可以应用到各类下游分子生物学实验。

适用范围

1、从植物组织、种子等提取基因组RNA；

2、从组织、血液、淋巴液、尿囊液、精液或各种核酸保存液中提取基因组RNA；

3、适用于核酸自动化提取平台。

试剂盒包装及组成

注意事项

1、所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程中应带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。

2、磁珠使用前一定要充分混匀。

3、结合液、洗脱液使用前请先分别加入55μL、12μL DEPC原液。

4、本试剂盒可分离纯化高质量基因组RNA，但仍有少许DNA掺杂，不影响一般实验。若下游实验对DNA非常敏感，可在洗脱后使用商业化DNaseI去除。

5、如果是干材料，适当延长裂解时间；种子用粉碎机打成粉末状使用，样品为种子时，裂解时间为20-25min。

6、如果同等取样量下欲得到纯度更高RNA 可以增加洗涤次数（洗涤次数最好不要超过3 次），也可以适当延长裂解时间。

操作步骤

1、裂解

研钵液氮预冷，取适量样本加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末，转移至1.5 mL EP 管中。然后加入600 μL RNA提取裂解液（65℃先行预热）、10 μL β-巯基乙醇（客户自备，在植物样品有褐化现象时添加，否则无需添加），吹打或点阵混合均匀。然后把EP 管置于恒温水箱中65℃温浴15～20min。

2.结合

将EP 管从温浴设备中取出，12000rpm 离心10min。取500 μL 上清，加入振荡混匀的磁珠30 μL、500 μL 结合液，颠倒混匀5min。将EP 管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液（吸净管盖及管底残液）。

3.洗涤

⑴ 加入1000 μL 75%乙醇-DEPC溶液（无水乙醇、超纯水，DEPC按照750:250:1混合），吸打或点振5～10 次，然后磁分离，注意吸净管盖及管底的残液；

⑵ 重复步骤⑴一次，室温下开盖干燥10~20min，注意防止污染。

4.洗脱

加入100 μL 洗脱液（使用前原装洗脱液请先加入12 μL DEPC原液），缓慢抽吸混匀，持续轻摇EP管15-20min。然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验。

常见问题及参考意见

得率低

（1）样品没有研磨充分，请尽量将样品研磨充分；

（2）组织没有完全裂解完，裂解时间不够或没有离心直接进行下一步操作；

可适当延长裂解时间，最长不超过60min。样品裂解后，请一定要离心后再进行下一步操作；

（3）结合不充分； 结合过程中要使磁珠一直处于悬浮状态，并且充分颠倒混匀；

（4）取样量大于说明书给出量； 取样量请严格按照说明书操作。

条带弥散

（1）样品不新鲜或反复冻融多次：尽量用新鲜样品进行试验，如果样品需要保存，请分装保存样品，尽量避免反复冻融；

（2）研磨时间太长，造成核酸降解：请研磨尽量迅速，防止RNA 降解；

（3）环境温度太高：请将研钵置于液氮保存后再进行研磨，如果所提取材料基因组极易降解，可用液氮研磨；

（4）裂解时间太长：裂解时间不要超过40min；

（5）提取后模板RNA 放置时间太长：提取后请尽量及时进行电泳试验。长期请置于-20℃保存（尽量注意避免反复冻融）。

RNA液有颜色

（1）洗涤过程不充分：如果结合后磁珠呈团状、丝状或颗粒状，要增加点震力度及次数，充分吹打混匀。

（2）裂解不充分：将组织充分研磨、适当增加RNA提取裂解液用量，也可以延长裂解时间。

（3）样品用量大于说明书给出量而其他试剂用量没有相应调整：严格按照说明书操作，如果需要增大样本量，可以等比例增大RNA提取裂解液、β-巯基乙醇以及磁珠用量，其他试剂用量可不改变。

RNA样品不纯，干扰后续实验

（1）RNA液有乙醇残留：洗涤时，请注意吸净管盖及管底的残液。此外，磁珠应完全干燥，保证无乙醇残留。

（2）磁珠洗涤不充分：加入75% 乙醇时，请吸打或点振混匀。如有必要，可增加一次洗涤步骤。

（3）RNA液中吸入磁珠：如果不小心吸入磁珠，请将上清液返回原管，待磁珠完全吸附至管壁后重新吸取上清。或者将吸取的上清液10,000rpm离心2min，再取上清。

（4）RNA液中含有蛋白质等杂质：建议适当减少样品用量。

（5）RNA液中含有轻微盐离子等杂质，此为洗脱液正常现象，不影响下游实验。如有特殊需要，可使用等量的经高压灭菌的0.1�PC水作为洗脱液。为方便实验，可将获得的RNA液置于-80℃环境分装保存。