One-Step 5x TMA PCR mix(恒温扩增试剂)


One-Step 5x TMA PCR mix(恒温扩增试剂)

 

I. 试剂盒货号

货号:

产品名称

RTQ202

One-Step 5x TMA PCR Mix, 200x25ul reactions (1ml)

RTQ210

One-Step 5x TMA PCR Mix,, 1000x25ul reactions (5ml)

 

II. 试剂盒原理

试剂包含M-MLV反转录酶(RNAse H )、T7 DNA polymerase、NTP、dNTP、Mg2 、RNAse Ihibitor、Buffer等.RNA转录、反转录以及DNA合成所需组分,仅需加入RNA或单链DNA模板即能开始恒等位RNA和DNA(双链)的合成反应

 

针对靶序列设计一对特异性引物,其中启动子引物上具有T7 RNA聚合酶识别的启动子序列,这一引物与靶序列结合后,在反转录酶的作用下进行反转录反应形成 杂交分子。反转录酶所具有的RNAseH活性可 以水解RNA-DNA杂交分子中的RNA,释放带有T7 RNA聚合酶结合序列的单链。然后另外一条引物与该单链DNA结合,通过反转录酶合成带有T7 RNA聚合酶结合序列双链DNA。T7 RNA聚合酶则以该双链DNA为模板进行转录,由一分子模板,可得到多个拷贝的RNA转录本,这些RNA转录本又进入反应,作为的起始模板重复上述步骤。反应过程图如下:

 

 

III. 注意事项

1. 使用前混匀试剂,上机前请将体系混匀;

2. 试剂具有一定粘性,吸取前请先润湿枪头;

3. -20℃保存

4. 如果不清楚所扩增的RNA或者单链DNA模板为正链还是反链,建议设计两套引物,其中一套引物的上游引物5’端添加T7-RNA 聚合酶结合序列,另外一套引物的下游引物5’端添加T7-RNA 聚合酶结合序列;

5. T7-RNA 聚合酶结合序列为:TAATACGACTCACTATAGGGAGA.

 

IV. 实验步骤

 

1. 混匀试剂盒中的PCR Mix。短暂离心使管中试剂集中于底部,冰上保存。

2. 按照下表内容,在冰上准备 PCR反应液。

试剂

25μl体系(其他体系按比例调整)

终浓度

One-Step 5x TMA PCR Mix

5μl

PCR Forward Primer(10μM)

0.3μ 

 

0.12μM

PCR Reverse Primer(10μM)

0.3μl 

0.12μM

RNA OR DNA template

5ng

0.2 ng /μl

ddH2O

补水至25μl(组分加完后混匀)


 

3. PCR反应条件

step 1

扩增反应

38-41.5 ℃

40min

视实际效果而定

step 1

产物分析

(凝胶电泳法)