一步法qPCR试剂 One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix


One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix说明书

I. 试剂盒货号

货号:

产品名称

RTQ102

One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix, 200x20ul reactions (0.8ml)

RTQ108

One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix, 800x20ul reactions (3.2ml)

 

 

II. 试剂盒原理

One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix包含M-MLV反转录酶、热启动Taq DNA  Polymerase 、dNTP、 Mg2 、RNAse Ihibitor、SYBR Green荧光染料、Buffer等.采用独特的体系,使逆转录和qPCR两种反应在同一管中进行,只需要加入RNA或DNA模板、特异性引物和 RNase-Free ddH2O 即可使 RT 和 Real Time PCR 反应有效的结合起来,快速的完成基因的定量检测。

1. 该产品具有很强的耐受性,高特 异性和稳定性。扩增效率高、特异性扩增能力强、错配率低等优点。

2. 简化实验操作程序,快速、高效的对RNA或DNA模板进行检测。

3. 减少非特异性扩增,提高 PCR 的准确性。u

4. 有效提高反应的扩增效率和特异性。 u

5. 更高的检测灵敏性,更强的热稳定性,更好的耐受性。

6. 试剂冻存不结冰,避免反复冻融,即用即取。

 

 

III. 注意事项

1. 使用前混匀;

2. 试剂具有一定粘性,吸取前请先润湿枪头;

3. 在上机前所有组份加样完成后,请务必震荡混匀或枪头吹匀反应体系;

4. 试剂盒-20℃避光保存。

 

 

IV. 实验步骤

 

1. 混匀试剂盒中的PCR Mix。短暂离心使管中试剂集中于底部,冰上保存。

2. 按照下表内容,在冰上准备 PCR反应液。

试剂

20μl体系(其他体系按比例调整)

终浓度

One-Step 5x RT-SYBR qPCR Mix

4μl

PCR Forward Primer(10μM)

0.4μl~0.5μl

 

0.2~0.25μM

PCR Reverse Primer(10μM)

0.4μl~0.5μl

0.2~0.25μM

RNA OR DNA template

1ng~1000ng

0.05~50 ng /μl

ddH2O

补水至20μl


 

3. PCR反应条件

 

step 1

反转录

48℃

5-15 min

视实际效果而定

step 2

预变性

95 ℃

3 min


PCR 扩增

95 ℃

12 s

40 cycles

58℃

30 s(read)

step 3

溶解曲线




 

应用ABI  7300/7500 和StepOnePlus 两步法 PCR 扩增标准程序:

Stage 1 1个循环 48℃,5-15分钟,时间视实际效果而定

Stage 2 1个循环预变性 95 3 分钟,

40个循环  95/12  58/30  

Stage 3 Melt Curve 

实验结果分析确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线等。

 

应用 CFX96™两步法 PCR 扩增标准程序:

Step 11个循环 48℃,5-15分钟,时间视实际效果而定

Step 21个循环 预变性 95 3 分钟

39个循环实际扩增有40 个循环 95 12  58 30 秒

Step 3Melt Curve  

实验结果分析确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线等。

 

 

注意:

1. 逆转录时间可根据实验需要进行调整,一般的内源基因如 β-Actin,只需要 5 分钟即可;检测特异的表达基因,可以根据需要适当延长逆转录时间15分钟

2. PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异。在具体操作中,需要根据目的片段大小、扩增片段的碱 基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况来设计最佳的反应条件,包括退火温度,延伸时间等。


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