kASP技术 定义
KASP是竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR） 的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中（甚至是一些复杂基因组的DNA 样品），对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。
SNP举例
InDel举例
KASP技术原理
Kasp 引物结构剖析（举例）：
RS7943316FAM（5’-3’） GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGA
RS7943316VIC （5’-3’） GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGT RS7943316R（5’-3’）
CCTCAGCAGGCAAATCTGCCTGTTG
区别于普通pcr由2条组成的扩增引物，kasp引物由3条组成：上游分型引物1、上游分型引物2和下游引物。其中下游引物与普通pcr引物结构和设计方法一样； 上游引物由3个部分组成：通用接头序列部分（蓝色） 普通扩增引物部分（划线） 分型位点/序列部分（ 红色）。
kasp实验难点部分在于引物设计， 一方面在于样本snp位点信息的准确性常常出错（主观因素）；另一方面在于其位置固定，只能直接面对序列的复杂结构（客观因素）。
进行Kasp实验的条件/步骤
1 样本及对应信息准备—— 首先需要有已经清楚需要检测的目标SNP/InDels 位点（未知目标位点可先进行少量亲本测序，比对分析确定位点后进行下一步操作），并且有相应的亲本；
2 引物准备—— 根据目标SNP/InDels位点，设计并合成kasp引物（引物设计及处理方法见后文附件一）；
3 试剂准备—— 准备好对应的检测试剂（现有试剂简介及推荐见后文）；
4 检测仪器准备—— 普通PCR扩增仪器 荧光酶标仪/荧光定量pcr仪 或者 只用荧光定量pcr仪 或者ArrayTape 系列高通量snp扩增分析仪
Kasp扩增程序条件解读
由于kasp实验面向的是单碱基区别扩增，比普通的pcr扩增具有更高要求的扩增严谨性。为此，kasp技术在扩增程序上设计了特殊的降落pcr扩增部分。
步骤 | 程序名称 | 温度 | 时间 | 循环数 | |
通用扩增程序 | |||||
一 | 预变性 | 95 ℃ | 10 min | 1 | |
二 | 降落PCR | 95 ℃ | 15 s | 10 | |
61-55 | 60 s | ||||
(- 0.6℃/cycle) | |||||
三 | 扩增 | 95 ℃ | 15 s | 2 8 （ 如分 | |
型不明显， | |||||
55 ℃ | 60 s | 可加5 循环 | |||
再读数） | |||||
四 | 荧光扫描 | 25~37 ℃ | 30 s | 1 |
Kasp实验结果展示
——以水稻GS3基因检测结果为例
样本名称 | 基因型 | 对应荧光接头序列 |
样本1 | CC | FAM接头序列 |
样本2 | AA | VIC接头序列 |
样本3 | CC | FAM接头序列 |
样本4 | CA | / |
样本5 | CA | / |
样本6 | AA | VIC接头序列 |
NTC1 | / | / |
NTC2 | / | / |
结果一目了然，直接导出收存！
Kasp技术与传统SSR/STR分子标记技术比对
区别项目 | kasp技术 | SSR/STR技术 |
原理基础 | DNA聚合酶扩增忠实性 | 不同碱基电泳速率差异性 |
技术难点 | 检测引物的设计 | 结果检测中的电泳操作 |
样本纯度要求 | 直扩或提纯 | 直扩或提纯 |
检测方法 | 终点荧光法 | 电泳法 |
灵敏度 | 能进行个位pg级数浓度的样本分型 | 一般要求百位pg级数浓度的样本浓度 |
实验时间（以测试4板384孔样本计 算） | 扩增1.5小时，即时出结果 | 扩增1.5小时，电泳检测约2小时，共3.5小时 |
仪器要求 | 较高，需要荧光扫描功能仪器（荧光酶标仪或者 荧光定量pcr仪器） | 较低，仅需要普通pcr仪器和电泳仪 |
试剂成本（单扩增试剂） | 0.8~1.1元/反应（10μL体系） | 0.5~0.8元/反应（10μL体系） |
检测目标 | 单等位基因SNP位点或者短InDels（1-5bp） | 简单序列重复数 |
应用领域 | 农业上 可用于性状基因的精细定位、分子辅助育种、种子资源鉴定； 医学上 可用于疾病的分子遗传机制研究、疾病基因定位、药物敏感或疾病易感性位点筛选。 |
主要用于农业上的性状基因的分子辅助育种、种子资源鉴定，医学上多用于DNA指纹图谱检测， 比如亲子鉴定等 |
kasp优势： 1 操作时间短，非常合适高通量操作； 2 通过荧光方法对检测结果进行分析，操作简单 | SSR/STR优势： 1 传统技术，容易被掌握和理解； 2 引物设计简单； 3 试剂成本相对稍低；
SSR/STR劣势 1 电泳的方法进行结果分析，工作量非常大，操作通量小，同时操作时间很长； 2 PCR产物开盖检测极容易造成实验污染，导致实验室体系瘫痪； 3 扩增区域一般存在等位基因数目过多现象，人工判别不准确，实验可重复性差，分布密度不足， 无法用于精细定位实验。 | |
结果直观，直接出检测报告； | ||
3 SNP具有分布密度高、遗传稳定性好、二等位 | ||
基因型的优势，可进行精细定位； | ||
优劣总结 | 4 可支持高/中/低通量操作； 5 pcr产物永久闭管状态，有效防止实验室污染。 | |
kasp劣势 1 引物设计需要一定的操作经验； 2 检测仪器要求较高； 3 试剂成本上稍比SSR/STR技术高。 |
SSR标记转化kasp检测标记实例详解
——以客户水稻Xa27 SSR方案转化kasp方案实例解说（因客户资料保密性，核心序列为修改序列，请勿引用）
KASP方案实施前，以SSR技术为主要检测手段，对相关性状作物进行筛查筛查引物
Xa27F： CAAGGTGCAATTATGATTTTTTAC；
Xa27R： ATGAATTTCTAATGTGGACTTC；产物约300bp。
检测方法
凝胶电泳/毛细管电泳
SSR方案转化kasp方案步骤
1 以Xa27F 、 Xa27R引物对两种亲本（分别为GX系列亲本、SX系列亲本）进行扩增，每系列亲本分别扩增10个样本，然后将产物进行测序；
2 对测序结果进行比对，寻找差异位点，然后将差异位点提取，明晰标出在Xa27的扩增序列上；
3 根据标出的差异位点进行kasp引物设计，并发送合成；
4 以GX系列亲本、SX系列亲本为模板，对所合成的引物进行有效性检测，筛选成功分型的引物；
5 以老SSR方案作为标准参照，对成功分型的引物进行群体样本分型验证，筛选与
SSR方案结果一致的引物，作为kasp方案待用引物；
6 申请相关性状新分子标记专利。
Kasp方法做精细定位实例详解
Kasp方案进行作物性状精细定位的基础：已对有该性状目标的亲本和无该性状的目标亲本进行基因组测序，并将基因组上的两亲本差异位点进行提取标识。
Kasp方法做精细定位步骤：
1对有该性状目标的亲本和无该性状的目标亲本进行基因组测序，并将基因组上的两亲本差异位点进行提取标识；
2 确定好筛选标记的间距，根据间距将基因组划分为若干区域，在每个区域中挑选1~3个差异位点进行kasp引物设计并将引物发送合成；
3 以两测序亲本作为模板，对引物进行筛选，每个区域要求至少筛选出一套能成功分型的位点及对应引物；
4 引物保存待用。
