KASP 2x PCR Mix 说明书
I. 试剂盒货号
GBS-1016-011 | KASP 2X PCR mix 96/384 V1 , 500x10ul reactions (2.5ml)，sto ROX |
GBS-1016-012 | KASP 2X PCR mix 96/384 V1 , 5,000x10ul reactions (25ml)，sto ROX |
GBS-1016-011-V2 | KASP 2X PCR mix 96/384 V2 , 500x10ul reactions (2.5ml)，sto ROX |
GBS-1016-012-V2 | KASP 2X PCR mix 96/384 V2 , 5,000x10ul reactions (25ml)，sto ROX |
GBS-1016-011-V3 | KASP 2X PCR mix 96/384 V3 , 500x10ul reactions (2.5ml)，sto ROX |
GBS-1016-012-V3 | KASP 2X PCR mix 96/384 V3 , 5,000x10ul reactions (25ml)，sto ROX |
KASP 2X PCR mix V1 为热启动时间3分钟的试剂，相比于V2和V3版本，有着超快的反应效率和时间，同时兼顾准确率和稳定性，一般上机时间控制在1小时以内，甚至缩短到45分钟。
KASP 2X PCR mix V2 为热启动时间3分钟的试剂，相比于V1和V3版本，更好的平衡效率，准确率和稳定性，在保证高准确率和稳定性，减少的上机反应时间，一般上机时间控制在1小时左右.
KASP 2X PCR mix V3 为热启动时间10分钟的试剂，相比于V1和V2版本，拥有超高的稳定性，适合于长时间运输和大规模制备样本，能保证在极端条件和一次性长时间操作中保证稳定性和高准确率。V3版本一般上机时间控制在1.5小时左右
II. KASP基因分型原理
Kompetitive Allele-Specific PCR(KASP)这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)。
实验流程主要包括：
• 准备：1）两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；2）带有不同荧光的两条检测引物PCR Mix；3）DNA 模板
• PCR反应I：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；
• PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；
• PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。
图1 KASP检测原理
III. 产品特点
1. 2x预混型反应试剂，包含SNP 分型所需组分，仅需加入DNA模板与引物即能开始反应。
2. 经久测试、优化，保存及工作性能稳定。
3. 组分预混，省时省事，极大降低污染可能性。
IV. 注意事项
1. 为了提高分型成功率，上游分型引物终浓度应≤200nM；
2. 注意避光保存。
3. 为保证使用效果，试剂盒保存于-20 °C，避免长期放置于4°C 或室温条件下。
4. 轻柔颠倒离心管数次以使试剂混合均匀，避免产生泡沫，短暂离心后备用。
5. 尽量使用无菌的蒸馏水。
V. 实验步骤
1. 解冻并轻柔混匀试剂盒中的PCR Mix。短暂离心使管中试剂集中于底部，冰上保存。
2. 按照下表内容，在冰上准备 PCR反应液。
添加组分 | 加量（2μl 体系） | 加量（10μl 体系） |
DNA Template | 5 ng – 50 ng | 25 ng – 250 ng |
FLu-Arms 2x PCR Mix | 1 μl | 5 μl |
上游分型引物F1（10μM） | 0.02 μL | 0.1 μL |
上游分型引物F2（10μM） | 0.02 μL | 0.1 μL |
下游通用引物R（10μM） | 0.06 μL | 0.3 μL |
补水至2μL | 补水至10 μL |
3. PCR反应条件
V1,V2版本
step 1 | 预变性 | 95℃ | 3 min | 1 循环 |
step 2 | 降落PCR | 95℃ | 15s | 9 循环 |
63.4→57℃,-0.8℃/循环 | 45 s | |||
step 3 | 扩增 | 95℃ | 15 s | 28循环 |
57.5℃ | 45 s | |||
step 4 | 读板 | 30℃ | 30 s （read） | 1 循环 |
V3版本
step 1 | 预变性 | 95℃ | 10 min | 1 循环 |
step 2 | 降落PCR | 95℃ | 15s | 10 循环 |
61→55℃,-0.6℃/循环 | 60 s | |||
step 3 | 扩增 | 95℃ | 15 s | 28~35循环 |
55℃ | 60 s | |||
step 4 | 读板 | 30℃ | 30 s （read） | 1 循环 |
表格中的循环数仅供初步参考，实际 DNA模板浓度 和 引物效率 会影响实际需要的循环数，具体确定方法可参考以下：
1. 如28个循环后，发现分型非常明显，且NTC（用于溶解模板的溶液）信号过高，与其他分型掺杂，下次扩增循环数调整为23~25；
2. 如28个循环后，发现所有信号区分不开，则将PCR产物用step 3的程序继续扩增5~ 7个循环后，再扫描荧光。