2X H-TECH SYBR qPCR Mix 使用说明书
l 试剂原理
2X H-TECH SYBR PCR Premix 是一种采用SYBR® Green I*嵌合荧光法进行Real Time PCR的试剂，体系中有PCR反应的必要组分Taq酶，dNTP Mixture，Mg2 ，Tli RNaseH，SYBR® Green I等，还有增强和稳定Real Time PCR反应的Buffer成分，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。
SYBR® Green I*与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBR® Green I*荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR® Green I*与双链DNA结合发出荧光，通过检测 PCR 反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的 DNA 片段的融解温度。
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l 主要试剂和耗材
PCR 引物
灭菌蒸馏水
PCR板
微量移液器和枪头（高压灭菌）
适用的 Real Time PCR 扩增仪
需要使用ROX low Dye 校正的仪器
Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System
Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Life Technologies)
需要使用ROX high Dye 校正的仪器
Applied Biosystems 7500 和 7500 Fast Real-Time PCR System(Life Technologies)
不需要使用 ROX Reference Dye 校正的仪器
Thermal Cycler Dice Real Time System
LightCycler®/LightCycler®480 System
Smart Cycler® System
CFX96™ Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）等
ROX参考货号：
货号 | 产品名称 | 规格 |
GDQ6005 | ROX low Dye 50X ROX high Dye 50X | 200ul 200ul |
l 保 存：
4℃保存 7天，-20℃一年以上
避光保存，避免污染。
冰袋运输，到货后-20℃避光保存。
l 注意事项：
1. 此试剂久置会有微量沉淀，为正常现象
2. 使用时请上下颠倒均匀混合，避免产生气泡，请勿涡旋剧烈振荡混匀。
3. 配制 PCR 反应液时应避免强光照射。试剂和引物、模板混合后尽快实验，效果最佳。
4. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。
5. 95℃预热时间最低不少于0.5 min；
● 操作方法
配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
无ROX反映体系
试剂 | 20μl体系（其他体系按比例调整） | 终浓度 |
2x PCR Premix | 10.0μl | 1× |
PCR Forward Primer（10μM） | 0.4μl~0.5μl
| 0.2~0.25μM |
PCR Reverse Primer（10μM） | 0.4μl~0.5μl | 0.2~0.25μM |
DNA template | 1ng~100ng（cDNA推荐） | 0.05~5 ng /μl |
ddH2O | 补水至20μl |
使用ROX反映体系
试剂 | 20μl体系（其他体系按比例调整） | 终浓度 |
2x PCR Premix | 10.0μl | 1× |
PCR Forward Primer（10μM） | 0.4μl~0.5μl
| 0.2~0.25μM |
PCR Reverse Primer（10μM） | 0.4μl~0.5μl | 0.2~0.25μM |
ROX low Dye or | 0.4μl | 1× |
ROX high Dye *2 | ||
DNA template | 1ng~100ng（cDNA推荐） | 0.05~5 ng /μl |
ddH2O | 补水至20μl |
*1 通常引物终浓度为 0.2 μM，可以在 0.1～1.0 μM 范围内调整。
*2 ROX high Dye比ROX low Dye浓度高，使用 7500 Real-Time PCR System时，使用ROX low Dye。使用7300 Real-Time PCR System 和StepOnePlus时，使用OX high Dye。
*3 在 20 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同模板中含有的目的基因拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的模板添加量。
Real Time PCR 上机程序举例：
建议采用两步法 PCR 反应程序
由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩增反应。
应用ABI 7300/7500 和StepOnePlus 两步法 PCR 扩增标准程序：
Stage 1： 1个循环 预变性 95℃ 3 分钟
Stage 2：40个循环 95℃/3秒 60℃/30秒 72℃/60秒
Stage 3： Melt Curve or Dissociation stage
实验结果分析：确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线等。
应用 CFX96™两步法 PCR 扩增标准程序：
Step 1：1个循环 预变性 95℃ 3 分钟
Step 2：GOTO：39（40 个循环） 95℃ 5 秒 60℃ 30 秒 72℃ 60秒
Step 3：Melt Curve
实验结果分析：确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线等。
特别提示：本公司提供从qPCR上机实验以及mRNA，lnRNA，circle RNA引物探针设计合成验证一条龙服务。