FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V3B说明书


FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V3B说明书

I. 试剂盒货号

货号:

产品名称

BGH1001RV3B

FLU-ARMS  for KASP 2X  PCR mix V3B 96/384 (2.5ml)sto ROX

BGH1025RV3B

FLU-ARMS  for KASP 2X  PCR mix V3B 96/384  (25ml)sto ROX

BGH1025RV3B.1

FLU-ARMS  for KASP 2X  PCR mix V3B.1 96/384  (1.25mlX20)sto ROX

BGH1125RV3B.1

FLU-ARMS  for KASP 2X  PCR mix V3B.1 96/384  (1.25mlX100)sto ROX

BGH1001HV3B

FLU-ARMS  for KASP 2X  PCR mix V3B 96/384 (2.5ml)High ROX

BGH1025HV3B

FLU-ARMS  for KASP 2X  PCR mix V3B 96/384  (25ml)High ROX

BGH1025HV3B.1

FLU-ARMS  for KASP 2X  PCR mix V3B.1 96/384  (1.25mlX20)High ROX

II. FLU-ARMS基因分型原理

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)这项技术类似,FLU-ARMS是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions,插入和缺失)。

实验流程主要包括:

  • 准备:1)两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix,两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列;2)带有不同荧光的两条检测引物PCR  Mix;3)DNA 模板

  • PCR反应I:变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火,延伸后序列被加上了检测引物的序列;

  • PCR反应II:等位基因特异性的末端序列的互补链合成;

  • PCR反应III:信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长,相应信号被检测。

FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V3B 热启动时间10分钟,拥有超高的稳定性,适合于大规模制备样本,能在极端条件和长时间操作中保证稳定性和高准确率。

 

  

 

1 Flu-Arms检测原理

 

 

III. 注意事项

1. 为提高分型成功率,上游分型引物终浓度应≤300nM;推荐浓度为100~200nM;

2. 试剂盒-20 °C避光保存。避免长期放置于4°C 或室温条件下。

3. 轻柔颠倒离心管数次以使试剂混合均匀,避免产生泡沫,短暂离心后备用。

4. 尽量使用无菌的蒸馏水。

IV. 实验步骤

1. 解冻并轻柔混匀试剂盒中的PCR Mix。短暂离心使管中试剂集中于底部,冰上保存。

2. 按照下表内容,在冰上准备 PCR反应液。

 

 

 

 

添加组分

加量(2μl 体系)

加量(10μl 体系)

DNA Template

5 ng – 50 ng

25 ng – 250 ng

FLu-Arms 2x PCR Mix

1 μl

5 μl

上游分型引物F1(10μM)

0.02 μL

0.1 μL

上游分型引物F2(10μM)

0.02 μL

0.1 μL

下游通用引物R(10μM)

0.06 μL

0.3 μL


补水至2μL

补水至10 μL

3. PCR反应条件

step 1

预变性

95℃

10 min

1 循环

step 2

降落PCR

95℃

15s

10 循环

61→55℃,-0.6℃/循环

60 s

step 3

扩增

95℃

15 s

28~35循环

55℃

60 s

step 4

读板

30℃

30 s (read)

1 循环

备注:

表格中的循环数仅供初步参考,实际 DNA模板浓度 和 引物效率 会影响实际需要的循环数,具体确定方法可参考以下:

1. 28个循环后,发现分型非常明显,且NTC(用于溶解模板的溶液)信号过高,与其他分型掺杂,下次扩增循环数调整为23~25;

2. 28个循环后,发现所有信号区分不开,则将PCR产物用step 3的程序扩增5~ 7个循环后,再扫描荧光。

3. 某些引物如加扩增超过40个循环,分型不集中,建议使用第二套程序,57度延伸42循环的方法,如下:

 

step 1

预变性

95℃

10 min

1 循环

step 2

降落PCR

95℃

15s

10 循环

6555℃,-1℃/循环

60 s

step 3

扩增

95℃

15 s

42循环

57

60 s

step 4

读板

30℃

30 s (read)

1 循环

 

V. FAQ

建议的PCR反应体系是怎样的?

96384/1536孔板,10µL 体系,其中4.5µl DNADNA浓度5~50ng/ul) 5µL mix, 0.5 µL引物,总体积10ul

384/1536孔板,5µL体系,其中2.25µl DNA DNA浓度5~50ng/ul) 2.5 µL mix, 0.25µL引物,总体积5ul

 

KASP实验注意问题

1 引物设计下游通用引物3端避开A,长度控制在60-120之间;另外,在引物合成前,记得确认下游引物是否已经采用反向互补序列

2 封石蜡油终点法检测,对体系均一性要求较高,需要用石蜡油封体系(先加石蜡油,后加试剂和模板,封好石蜡油封96孔板,用或不用贴膜都可以),10ul体系以下推荐加10ul石蜡油,11-20ul体系推荐加20ul石蜡油;

3 模板浓度模板浓度不能过高,10ul体系,一般理想加量控制在25-100ng之间,加量过大可能会导致分型点较散;

4 循环数首次使用新引物,应对该引物最合适循环数进行摸索,从28循环起,每4循环收集一次结果,找出最优结果循环数,以后可以直接调用该循环数;

5 加样操作常温下加样,加样前应尽量事先准备好实验过程需要用到或需要做的事情(比如事先加好石蜡油、事先计算并分装好引物、事先解冻或者稀释好模板等),尽量缩短试剂在常温下操作的时;