FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V3B说明书
I. 试剂盒货号
货号: | 产品名称 |
BGH1001RV3B | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V3B 96/384 (2.5ml),sto ROX |
BGH1025RV3B | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V3B 96/384 (25ml),sto ROX |
BGH1025RV3B.1 | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V3B.1 96/384 (1.25mlX20),sto ROX |
BGH1125RV3B.1 | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V3B.1 96/384 (1.25mlX100),sto ROX |
BGH1001HV3B | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V3B 96/384 (2.5ml),High ROX |
BGH1025HV3B | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V3B 96/384 (25ml),High ROX |
BGH1025HV3B.1 | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V3B.1 96/384 (1.25mlX20),High ROX |
II. FLU-ARMS基因分型原理
和KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)这项技术类似,FLU-ARMS是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions,插入和缺失)。
实验流程主要包括:
• 准备:1)两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix,两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列;2)带有不同荧光的两条检测引物PCR Mix;3)DNA 模板
• PCR反应I:变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火,延伸后序列被加上了检测引物的序列;
• PCR反应II:等位基因特异性的末端序列的互补链合成;
• PCR反应III:信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长,相应信号被检测。
FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V3B 热启动时间10分钟,拥有超高的稳定性,适合于大规模制备样本,能在极端条件和长时间操作中保证稳定性和高准确率。
图1 Flu-Arms检测原理
III. 注意事项
1. 为提高分型成功率,上游分型引物终浓度应≤300nM;推荐浓度为100~200nM;
2. 试剂盒-20 °C避光保存。避免长期放置于4°C 或室温条件下。
3. 轻柔颠倒离心管数次以使试剂混合均匀,避免产生泡沫,短暂离心后备用。
4. 尽量使用无菌的蒸馏水。
IV. 实验步骤
1. 解冻并轻柔混匀试剂盒中的PCR Mix。短暂离心使管中试剂集中于底部,冰上保存。
2. 按照下表内容,在冰上准备 PCR反应液。
添加组分 | 加量(2μl 体系) | 加量(10μl 体系) |
DNA Template | 5 ng – 50 ng | 25 ng – 250 ng |
FLu-Arms 2x PCR Mix | 1 μl | 5 μl |
上游分型引物F1(10μM) | 0.02 μL | 0.1 μL |
上游分型引物F2(10μM) | 0.02 μL | 0.1 μL |
下游通用引物R(10μM) | 0.06 μL | 0.3 μL |
补水至2μL | 补水至10 μL |
3. PCR反应条件
step 1 | 预变性 | 95℃ | 10 min | 1 循环 |
step 2 | 降落PCR | 95℃ | 15s | 10 循环 |
61→55℃,-0.6℃/循环 | 60 s | |||
step 3 | 扩增 | 95℃ | 15 s | 28~35循环 |
55℃ | 60 s | |||
step 4 | 读板 | 30℃ | 30 s (read) | 1 循环 |
备注:
表格中的循环数仅供初步参考,实际 DNA模板浓度 和 引物效率 会影响实际需要的循环数,具体确定方法可参考以下:
1. 如28个循环后,发现分型非常明显,且NTC(用于溶解模板的溶液)信号过高,与其他分型掺杂,下次扩增循环数调整为23~25;
2. 如28个循环后,发现所有信号区分不开,则将PCR产物用step 3的程序加扩增5~ 7个循环后,再扫描荧光。
3. 某些引物如加扩增超过40个循环,分型不集中,建议使用第二套程序,57度延伸42循环的方法,如下:
step 1 | 预变性 | 95℃ | 10 min | 1 循环 |
step 2 | 降落PCR | 95℃ | 15s | 10 循环 |
65→55℃,-1℃/循环 | 60 s | |||
step 3 | 扩增 | 95℃ | 15 s | 42循环 |
57℃ | 60 s | |||
step 4 | 读板 | 30℃ | 30 s (read) | 1 循环 |
V. FAQ
建议的PCR反应体系是怎样的?
96和384/1536孔板,10µL 体系,其中4.5µl DNA(DNA浓度5~50ng/ul), 5µL mix, 0.5 µL引物,总体积10ul。
384/1536孔板,5µL体系,其中2.25µl DNA (DNA浓度5~50ng/ul), 2.5 µL mix, 0.25µL引物,总体积5ul。
KASP实验注意问题
1 引物设计:下游通用引物3端避开A,长度控制在60-120之间;另外,在引物合成前,记得确认下游引物是否已经采用反向互补序列
2 封石蜡油:终点法检测,对体系均一性要求较高,需要用石蜡油封体系(先加石蜡油,后加试剂和模板,封好石蜡油封96孔板,用或不用贴膜都可以),10ul体系以下推荐加10ul石蜡油,11-20ul体系推荐加20ul石蜡油;
3 模板浓度:模板浓度不能过高,10ul体系,一般理想加量控制在25-100ng之间,加量过大可能会导致分型点较散;
4 循环数:首次使用新引物,应对该引物最合适循环数进行摸索,从28循环起,每4循环收集一次结果,找出最优结果循环数,以后可以直接调用该循环数;
5 加样操作:常温下加样,加样前应尽量事先准备好实验过程需要用到或需要做的事情(比如事先加好石蜡油、事先计算并分装好引物、事先解冻或者稀释好模板等),尽量缩短试剂在常温下操作的时;
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