FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V5A说明书
I. 试剂盒货号
货号： | 产品名称 |
BGH1001RV5A | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V5A 96/384 (2.5ml)，sto ROX |
BGH1025RV5A | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V5A 96/384 (25ml)，sto ROX |
BGH1025RV5A.1 | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V5A.1 96/384 (1.25mlX20)，sto ROX |
BGH1001HV5A | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V5A 96/384 (2.5ml)，High ROX |
BGH1025HV5A | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V5A 96/384 (25ml)，High ROX |
BGH1025HV5A.1 | FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix V5A.1 96/384 (1.25mlX20)，High ROX |
II. FLU-ARMS基因分型原理
和KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR)这项技术类似，FLU-ARMS是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)。
实验流程主要包括：
• 准备：1）两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；2）带有不同荧光的两条检测引物PCR Mix；3）DNA 模板
• PCR反应I：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；
• PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；
• PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。
FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V5A 热启动时间1分钟，拥有超快的反应效率，一次反应在30~40分钟内完成，适合于快速筛选位点，最短时间完成大批量实验，并保证稳定性和高准确率。
图1 FLU-ARMS检测原理
III. 注意事项
1. 为提高分型成功率，上游分型引物终浓度应≤300nM；推荐浓度为100~200nM；
2. 试剂盒-20 °C避光保存。避免长期放置于4°C 或室温条件下。
3. 轻柔颠倒离心管数次以使试剂混合均匀，避免产生泡沫，短暂离心后备用。
4. 尽量使用无菌的蒸馏水。
IV. 实验步骤
1. 解冻并轻柔混匀试剂盒中的PCR Mix。短暂离心使管中试剂集中于底部，冰上保存。
2. 按照下表内容，在冰上准备 PCR反应液。
添加组分 | 加量（2μl 体系） | 加量（10μl 体系） |
DNA Template | 5 ng – 50 ng | 25 ng – 250 ng |
FLU-ARMS 2x PCR Mix | 1 μl | 5 μl |
上游分型引物F1（10μM） | 0.02 μL | 0.1 μL |
上游分型引物F2（10μM） | 0.02 μL | 0.1 μL |
下游通用引物R（10μM） | 0.06 μL | 0.3 μL |
补水至2μL | 补水至10 μL |
3. PCR反应条件
step 1 | 预变性 | 95℃ | 10 min | 1 循环 |
step 2 | 降落PCR | 95℃ | 15 s | 10循环 |
61-55℃,-0.6℃/循环 | 60 s | |||
step 3 | 扩增 | 95℃ | 15s | 28-35 循环 |
55℃ | 60s | |||
Step 4 | 读板 | 30℃ | 30s（read） | 1循环 |
备注：
表格中的循环数仅供初步参考，实际 DNA模板浓度 和 引物效率 会影响实际需要的循环数，具体确定方法可参考以下：
1. 如28个循环后，发现分型非常明显，且NTC（用于溶解模板的溶液）信号过高，与其他分型掺杂，下次扩增循环数调整为23-25；
2. 如28个循环后，发现所有信号区分不开，则将PCR产物用step 2的程序继续扩增5~ 7个循环后，再扫描荧光。
V. FAQ
建议的PCR反应体系是怎样的？
96和384/1536孔板，10µL 体系，其中2µl DNA（DNA浓度25~50ng/ul）， 5µL mix, 0.5 µL引物，补水至10ul。
384/1536孔板，5µL体系，其中1µl DNA （DNA浓度25~50ng/ul）， 2.5 µL mix, 0.25µL引物，补水至5ul。
FLU-ARMS技术对DNA的要求？
建议最小的DNA浓度不低于5 ng / µL。
不同基因组大小所需的DNA的量为：待测样品基因组/3000Mb*5ng。
建议设置DNA浓度梯度实验，来确定最合适的DNA浓度。
粗提的DNA即可满足实验需求，请尽量保证DNA浓度的一致性,
提取DNA尽量不要用到EDTA。如有EDTA，建议将DNA稀释一下，做一下浓度梯度实验或加MgCl2优化。
多个引物可以同时跑在同一块板子上吗？
可以，但FLU-ARMS技术要求每个引物至少跑18个样品加两个NTC，否则可能影响分群判读，造成较大的误差
FLU-ARMS试剂的储存条件及建议是什么？
FLU-ARMS 引物可在4度保存最长至1个月，更长时间的存放建议储存在-20度以下； FLU-ARMS 2x PCR Mix用完后尽量马上放置-20度以下避光保存，冻融尽量不要超过5次！