Real Time PCR，即实时荧光定量PCR，也被称为定量PCR或qPCR，是实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法。 |
1.定量的基本原理
qPCR通过荧光信号值实时监控PCR扩增产物的变化，在指数扩增期进行定量分析。PCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久达到平台期。假设起始DNA的量为A0，经过了n个循环后，理论上DNA产物的量可以表示为：An=A0×2n那么，起始DNA量A0越多，扩增产物的量便越早达到检出值An，达到An时的循环圈数即Ct值。也就是起始DNA量A0越多，扩增曲线越早起峰，对应需要的循环圈数n越小。
我们将已知浓度的标准品进行梯度稀释，作为模板进行Real Time PCR，就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。根据Ct值与起始模板数的对数值之间的线性关系，就可以制作出【标准曲线】。
未知浓度的样品的Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量，这就是qPCR的定量原理。
2.标准曲线
进行绝对定量，需要使用浓度已知的标准品来制作标准曲线。
对qPCR引物进行性能验证时，也需要制作标准曲线来判断。
下面就是如何选择标准品，如何制作标准曲线，以及如何评价标准曲线的介绍。
》标准品的制备
标准品要满足以下条件：
1. 浓度或拷贝数是已知的。
2. 与实际检测样品间的扩增效率一致。
如果待检测的模板是基因组DNA，就要选择基因组DNA作为标准品。但很难获得目的基因浓度是已知的基因组DNA时，或者目的基因的丰度较低时，对于DNA起始的材料必须构建质粒。
所构建的质粒标准品，不仅要具有目的序列，还要在目的序列的两侧各多加一段序列，使其更加接近实际检测样品的结构，以保持与实际检测样品间的扩增效率的一致性。
进行mRNA表达解析时，最好选择表达目的基因的Total RNA或以Total RNA为模板合成的cDNA作为标准品。但很难获得目的基因浓度是已知的的Total RNA时，必须构建体外转录RNA。
》标准曲线的制作
标准曲线的制作不需要人工操作，由仪器自动完成。
》理想的标准曲线
评价标准曲线的优劣有两个指标，相关系数（r 2）和斜率（slope）。
相关系数反映标准曲线的直线性，理想值应大于0.98，越接近于1说明直线性越好，定量越准确。
斜率反映PCR扩增效率（E），PCR理想的扩增效率应在0.9<E<1.1范围, 如果PCR扩增效率低时必须重新设计引物; 如果PCR扩增效率比理论值高时，说明反应体系中有可能存在对反转录反应或PCR反应的阻害物质，需要改进提取方法。
3.融解曲线
采用TB Green荧光嵌合法检测时，可以通过融解曲线分析，确认PCR反应的特异性。
》融解曲线分析的原理
PCR反应结束后，将PCR反应液的温度渐渐升高，实时监测TB Green的荧光信号强度变化。
左图为融解曲线的一次曲线，右图为融解曲线的负一次微分曲线，通常使用融解曲线的负一次微分曲线进行分析的较多。
Tm值与PCR扩增产物的序列有关，对于某一PCR扩增产物，其值是固定的。
理想的融解曲线应该是只有单一峰型的曲线，如果出现两个以上的峰型，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生，需要对条件进行优化或重新设计引物。
