FLU-ARMS for KASP 技术手册


广州固德生物技术有限公司成立于2015年,是一家产学研相结合,集试剂仪器研发、生产及技术服务为一体的生物高科技企业。涉足于生命科学和大健康领域。


一、FLU-ARMS 技术原理

 

竞争性等位基因特异性PCR (Competitive Allele Specific PCR)KASP,可对广泛的基因组DNA样品,包括复杂基因组DNA样品,对目标SNPs和InDels进行精准的双等位基因分型

和 KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)这项技术类似,FLU-ARMS 是基于引物末端碱基的特异匹配来对 SNP 分型以及检测 InDels

(Insertions and Deletions,插入和缺失)。

实验流程主要包括:

• 准备:1)两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的 Primer Mix,两条正向引物 5’端分别连有不同序列的检测引

物序列;2)带有不同荧光的两条检测引物 PCR Mix;3)DNA 模板

• PCR 反应 I:变性模板与 Primer Mix 中相匹配的引物结合并退火,延伸后序列被加上了检测引物的序列;

• PCR 反应 II:等位基因特异性的末端序列的互补链合成;

• PCR 反应 III:信号产生---特异序列对应的检测引物随 PCR 反应进行指数性增长,相应信号被检测。

FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V4 热启动时间 10 分钟,拥有超高的稳定性,适合于大规模制备样本,能在极端条件和长时间操作中保证稳定性和高准确率

 

SNP举例

GGTGCTGATTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGG[A/T]CTCGGGGCAACAGGCAGATTTGCCTGCTGAGGGTGGAGACCCACGAGCCGAGGCCTCCTGCAGTGTTCTGCACAG

InDel举例

GGTGCTGATTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGG[-/CGT]CTCGGGGCAACAGGCAGATTTGCCTGCTGAGGGTGGAGACCCACGAGCCGAGGCCTCCTGCAGTGTTCTGCACAG

 

二、 引物设计步骤

 

下游通用引物 3 端避开 A,长度控制在 60-120 之间;另外,在引物合成前,记得确认下游引物是否已经采用反向互补序列

RS7943316位点序列为

 

GGTGCTGATTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGG[A/T]CTCGGGGCAACAGGCAGATTTGCCTGCTGAGGGTGGAGACCCACGAGCCGAGGCCTCCTGCAGTGTTCTGCACAG

 

kasp测引物设计后可直接发送合成的序列如下:

RS7943316FAM(5’-3’)GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGA

RS7943316VIC  (5’-3 ) GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGT

RS7943316R(5’-3’ )  CCACCCTCAGCAGGCAAATCTGCCTGTTG

步骤说明

1首先明确目标检测位点(如图中红色部分),在位点的左侧或者右侧(如图中划线部分,在右侧设计需要用反向互补序列)设计上游分型引物,上游分型引物长度推荐选择24bp(不含SNP位点,此处忽略TM值问题)

 

2在设计好的上游分型引物5’末端,分别加上FAMVIC接头序列(如图中灰色部分)

 

3设计下游共同引物(如图中黄色部分)3’端避开A碱基,引物长度推荐选择29bp(此处忽略TM值问题),下游共同引物合成时,记得采用反向互补序列(请看比对序列中的黄色部分及设计后发送合成的黄色部分)

 

4整个扩增产物(如上图方框部分)的长度,推荐为60-120bp

 

5RS7943316FamRS7943316VICRS7943316R三引物直接发送引物合成公司合成;

6RS7943316FamRS7943316VICRS7943316R合成回来后,用TE溶解,溶解浓度推荐为50μM

 

7引物混合。将充分溶解后的引物,按照RS7943316Fam(50μM)RS7943316VIC(50μM)RS7943316R(50μM)=113体积比例混合,充分混匀后即可使用。

混合引物用量推荐为0.15μL/10μL体系,其他浓度混合的引物,可按照比例缩放加量。

 

8引物合成:推荐合成纯化方式PAGE上,2OD合成量足够5000以上反应。

 

引物名称

引物序列(53)

引物长度/bp

5'端修饰

3'端修饰

纯化方式

合成量/OD

每管分装量/OD

AE1 F1

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGA

45

PAGE

2

2

AE1 F2

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGT

46

PAGE

2

2

AE1 R

CCACCCTCAGCAGGCAAATCTGCCTGTTG

 

29

PAGE

2

2

 

 

三、DNA样品处理

模板浓度。模板浓度不能过高,10ul 体系,一般理想加量控制在 25- 100ng 之间,加量 可能会导致分型点较散;

 

植物DNA快速提取方法总结:

 

(一)  碱煮法(通用试剂 非中和碱煮法,相对而言较适合像番茄这种叶子较厚、较软的植物)

裂解液配方:25mM NaOH0.2 mM EDTA

操作流程

1.          剪切植物叶子25px至管子(或者深孔板)中,按照200uL裂解液每厘米叶子 比例,加入裂解液;

2.          在管子(或者深孔板)中加入钢珠,将叶子适当研磨;(叶子要是已剪碎至不超过3mm的长度,根据实际效果可尝试省略此步骤)

3.          将管子(或者深孔板)至于沸水中煮沸加热10分钟;

4.          管子(或者深孔板)轻度离心,将管壁液体甩至底部;

5.          将煮沸后的DNA抽提液用水稀释3倍(或6倍),后可直接上机(DNA在体系中加量常在20%~50%,推荐为50%

6.          处理之后(含稀释前后),可在4°C保存1一个月,更长时间请至于-20°C保存。

 

(二 碱煮法(通用试剂 中和碱煮法,通用于所有作物叶子)

裂解液A配方:100mM NaOH2 mM EDTA

裂解液B配方:15mMTrisPH 6.5

操作流程

1.          剪切植物叶子25px至管子(或者深孔板)中,按照200uL裂解液A每厘米叶子 比例,加入裂解液;

2.          在管子(或者深孔板)中加入钢珠,将叶子适当研磨;(叶子要是已剪碎至不超过3mm的长度,根据实际效果可尝试省略此步骤)

3.          将管子(或者深孔板)至于沸水中煮沸加热10分钟;

4.          管子(或者深孔板)轻度离心,将管壁液体甩至底部;

5.          10uL煮沸后的DNA抽提液,用90uL裂解液B稀释10倍,后可直接上机(DNA在体系中加量常在20%~50%,推荐为50%

6.          处理之后(含稀释前后),可在4°C保存1一个月,更长时间请至于-20°C保存。

 

(三) 简化CTAB法(通用试剂 省去烘干步骤)

1.          50px长水稻叶片,在96深孔板里,加5mm钢珠一颗,加500ul TPS提取液;

2.          高通量研磨机1400rpm X 40S

3.          离心3600rpm  X 5 min

4.          100ul上清至普通透明PCR板,加等量冰冻95%乙醇,摇匀

5.          4680rpm X 12min

6.          倒扣掉上清,离心轻甩管壁液体至管底;

7.          加入100uL水溶解DNA后可以直接上机(DNA在体系中加量常在20%~50%,推荐为50%)。

 

(四)极简化CTAB法(配套试剂 省去沉淀/烘干步骤)(此方案正在做稳定性测试,即将推出)

1.          50px长水稻叶片,在96深孔板里,加5mm钢珠一颗,加400ul TPS提取液;

2.          高通量研磨机1400rpm X 40S

3.          吸取10ul研磨液体至90ul水中,混匀,直接上机(DNA在体系中加量常在20%~50%,推荐为50%)。

 

1L TPS 配方

1MPH8.0Tris-HCl  100ml

0.5M EDTA(PH8.0)     20ml

Kcl                  74.5g

d2H2o               1L

 

 

 

四、上机技巧

 

封石蜡油终点法检测,对体系均一性要求较高,需要用石蜡油封体系 (先加石蜡油, 加试和模板,封好石蜡油封 96 孔板,用或不用贴膜都可以) ,10ul 体系以下推荐加 10ul 石蜡油11-20ul 体系推荐加 20ul 石蜡油;

加样操作:常温下加样,加样前应尽量事先准备好实验过程需要用到或需要做的事情 (比 如事先加好石蜡油、事先计算并分装好引物、事先解冻或者稀释好模板等),尽量缩短试剂 在常温下操作的时间。

循环数:首次使用新引物,应对该引物最合适循环数进行摸索,从 28 循环起,每 4 循环收集一次结果,找出最优结果循环数,以后可以直接调用该循环数;

 

五、分析技巧

 

不同引物不在同一个界面分析。因为不同引物扩增效率不同,分析图案不一样,不建议在同一界面分析。可以先在设置样本的时候同时填写不同的引物,或分析的时候先把不同引物的孔位OMIT(忽略)后重新分析。

 

 

 

 

2 明明有聚类,系统不能自动分型,这个时候需要手动分型,人工判读。或有些自动判读的结果不可信,需要手动修改

 

3 要阴性对照怎么设置:

加样的时候除了DNA,其他都需要加,包括引物,酶试剂,和DNA的溶剂(水或TE)才能算阴性对照

 

4 阳性对照怎么设置:

如果有清楚的父母本或之前分型成功的样本可以做阳性对照。一般情况下,如果群体样本里有多态性,在96孔以上的反应体系里,会自动聚类分型,可以不用阳性对照

 

5 为什么我的图像只有折现,没有聚类图:

再分型界面里选相关的分析选项Allelic选项

 

 

 

6荧光大部分还在阴性对照附近

这种情况是,循环数不够,或酶效率不高,或DNA质量不好引起反向效率不够。尝试加循环

 

 

7某些荧光值异常高,大部分还在阴性对照附近

这种情况是,是读板仪器污染后某些孔污染异常,忽略或OMIT这些孔位,重新分析

 

 

 第一次操作需要注意什么:

阳性质控样本复孔

 

DNA浓度

第一次测试,后续不敏感

叶片DNA稀释10倍上机。

 

我的机器适合做flu-arms>

Thermo/ABI: QS3QS5/6/7,7500, 7900Vii7(stepone,7300请咨询公司)

BioradCFX96CFX connectCFX384IQ5

罗氏:L480,L480II

LGCiquant,道格拉斯,OMGEA FSNPline

天隆:TL988VIE96