广州固德生物技术有限公司成立于2015年，是一家产学研相结合，集试剂仪器研发、生产及技术服务为一体的生物高科技企业。涉足于生命科学和大健康领域。
一、FLU-ARMS 技术原理
竞争性等位基因特异性PCR (Competitive Allele Specific PCR)KASP，可对广泛的基因组DNA样品，包括复杂基因组DNA样品，对目标SNPs和InDels进行精准的双等位基因分型
和 KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR)这项技术类似，FLU-ARMS 是基于引物末端碱基的特异匹配来对 SNP 分型以及检测 InDels
(Insertions and Deletions，插入和缺失)。
实验流程主要包括：
• 准备：1）两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的 Primer Mix，两条正向引物 5’端分别连有不同序列的检测引
物序列；2）带有不同荧光的两条检测引物 PCR Mix；3）DNA 模板
• PCR 反应 I：变性模板与 Primer Mix 中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；
• PCR 反应 II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；
• PCR 反应 III：信号产生---特异序列对应的检测引物随 PCR 反应进行指数性增长，相应信号被检测。
FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V4 热启动时间 10 分钟，拥有超高的稳定性，适合于大规模制备样本，能在极端条件和长时间操作中保证稳定性和高准确率
SNP举例
GGTGCTGATTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGG[A/T]CTCGGGGCAACAGGCAGATTTGCCTGCTGAGGGTGGAGACCCACGAGCCGAGGCCTCCTGCAGTGTTCTGCACAG
InDel举例
GGTGCTGATTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGG[-/CGT]CTCGGGGCAACAGGCAGATTTGCCTGCTGAGGGTGGAGACCCACGAGCCGAGGCCTCCTGCAGTGTTCTGCACAG
二、 引物设计步骤
下游通用引物 3 端避开 A，长度控制在 60-120 之间；另外，在引物合成前，记得确认下游引物是否已经采用反向互补序列
以RS7943316位点序列为例
GGTGCTGATTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGG[A/T]CTCGGGGCAACAGGCAGATTTGCCTGCTGAGGGTGGAGACCCACGAGCCGAGGCCTCCTGCAGTGTTCTGCACAG
kasp检测引物设计后可直接发送合成的序列如下：
RS7943316FAM(5’-3’)GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGA
RS7943316VIC (5’-3 ) GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGT
RS7943316R(5’-3’ ) CCACCCTCAGCAGGCAAATCTGCCTGTTG
步骤说明
1首先明确目标检测位点(如图中红色部分)，在位点的左侧或者右侧(如图中划线部分，在右侧设计需要用反向互补序列)设计上游分型引物，上游分型引物长度推荐选择24bp(不含SNP位点，此处忽略TM值问题)；
2在设计好的上游分型引物5’末端，分别加上FAM、VIC接头序列(如图中灰色部分)；
3设计下游共同引物(如图中黄色部分)的3’端避开A碱基，引物长度推荐选择29bp(此处忽略TM值问题),下游共同引物合成时，记得采用反向互补序列(请看比对序列中的黄色部分及设计后发送合成的黄色部分)；
4整个扩增产物(如上图方框部分)的长度，推荐为60-120bp；
5将RS7943316Fam、RS7943316VIC、RS7943316R三引物直接发送引物合成公司合成；
6RS7943316Fam、RS7943316VIC、RS7943316R合成回来后，用TE溶解，溶解浓度推荐为50μM；
7引物混合。将充分溶解后的引物，按照RS7943316Fam(50μM)：RS7943316VIC(50μM)：RS7943316R(50μM)=1：1：3体积比例混合，充分混匀后即可使用。
混合引物用量推荐为0.15μL/10μL体系,其他浓度混合的引物，可按照比例缩放加量。
8引物合成：推荐合成纯化方式PAGE上，2OD合成量足够5000以上反应。
引物名称 | 引物序列(5→3) | 引物长度/bp | 5'端修饰 | 3'端修饰 | 纯化方式 | 合成量/OD | 每管分装量/OD |
AE1 F1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGA | 45 | 无 | 无 | PAGE | 2 | 2 |
AE1 F2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGCTGAGCCTGAAGTCGCCACGGT | 46 | 无 | 无 | PAGE | 2 | 2 |
AE1 R | CCACCCTCAGCAGGCAAATCTGCCTGTTG
| 29 | 无 | 无 | PAGE | 2 | 2 |
三、DNA样品处理
模板浓度。模板浓度不能过高，10ul 体系，一般理想加量控制在 25- 100ng 之间，加量过 大可能会导致分型点较散；
植物DNA快速提取方法总结：
（一） 碱煮法（通用试剂 非中和碱煮法，相对而言较适合像番茄这种叶子较厚、较软的植物）
裂解液配方：25mM NaOH，0.2 mM EDTA
操作流程
1. 剪切植物叶子25px至管子（或者深孔板）中，按照200uL裂解液每厘米叶子 比例，加入裂解液；
2. 在管子（或者深孔板）中加入钢珠，将叶子适当研磨；（叶子要是已剪碎至不超过3mm的长度，根据实际效果可尝试省略此步骤）
3. 将管子（或者深孔板）至于沸水中煮沸加热10分钟；
4. 管子（或者深孔板）轻度离心，将管壁液体甩至底部；
5. 将煮沸后的DNA抽提液用水稀释3倍（或6倍），后可直接上机（DNA在体系中加量常在20%~50%，推荐为50%）
6. 处理之后（含稀释前后），可在4°C保存1一个月，更长时间请至于-20°C保存。
（二 ） 碱煮法（通用试剂 中和碱煮法，通用于所有作物叶子）
裂解液A配方：100mM NaOH，2 mM EDTA
裂解液B配方：15mMTris（PH 6.5）
操作流程
1. 剪切植物叶子25px至管子（或者深孔板）中，按照200uL裂解液A每厘米叶子 比例，加入裂解液；
2. 在管子（或者深孔板）中加入钢珠，将叶子适当研磨；（叶子要是已剪碎至不超过3mm的长度，根据实际效果可尝试省略此步骤）
3. 将管子（或者深孔板）至于沸水中煮沸加热10分钟；
4. 管子（或者深孔板）轻度离心，将管壁液体甩至底部；
5. 取10uL煮沸后的DNA抽提液，用90uL裂解液B稀释10倍，后可直接上机（DNA在体系中加量常在20%~50%，推荐为50%）
6. 处理之后（含稀释前后），可在4°C保存1一个月，更长时间请至于-20°C保存。
（三） 简化CTAB法（通用试剂 省去烘干步骤）
1. 取50px长水稻叶片，在96深孔板里，加5mm钢珠一颗，加500ul TPS提取液；
2. 高通量研磨机1400rpm X 40S；
3. 离心3600rpm X 5 min；
4. 吸100ul上清至普通透明PCR板，加等量冰冻95%乙醇，摇匀
5. 4680rpm X 12min
6. 倒扣掉上清，离心轻甩管壁液体至管底；
7. 加入100uL水溶解DNA后可以直接上机（DNA在体系中加量常在20%~50%，推荐为50%）。
（四）极简化CTAB法（配套试剂 省去沉淀/烘干步骤）（此方案正在做稳定性测试，即将推出）
1. 取50px长水稻叶片，在96深孔板里，加5mm钢珠一颗，加400ul TPS提取液；
2. 高通量研磨机1400rpm X 40S；
3. 吸取10ul研磨液体至90ul水中，混匀，直接上机（DNA在体系中加量常在20%~50%，推荐为50%）。
1L TPS 配方
1M（PH8.0）Tris-HCl 100ml
0.5M EDTA(PH8.0) 20ml
Kcl 74.5g
d2H2o 1L
四、上机技巧
封石蜡油：终点法检测，对体系均一性要求较高，需要用石蜡油封体系 (先加石蜡油，后 加试剂和模板，封好石蜡油封 96 孔板，用或不用贴膜都可以) ，10ul 体系以下推荐加 10ul 石蜡油，11-20ul 体系推荐加 20ul 石蜡油；
加样操作：常温下加样，加样前应尽量事先准备好实验过程需要用到或需要做的事情 (比 如事先加好石蜡油、事先计算并分装好引物、事先解冻或者稀释好模板等)，尽量缩短试剂 在常温下操作的时间。
循环数：首次使用新引物，应对该引物最合适循环数进行摸索，从 28 循环起，每 4 循环收集一次结果，找出最优结果循环数，以后可以直接调用该循环数；
五、分析技巧
1 不同引物不在同一个界面分析。因为不同引物扩增效率不同，分析图案不一样，不建议在同一界面分析。可以先在设置样本的时候同时填写不同的引物，或分析的时候先把不同引物的孔位OMIT（忽略）后重新分析。
2 明明有聚类，系统不能自动分型，这个时候需要手动分型，人工判读。或有些自动判读的结果不可信，需要手动修改
3 要阴性对照怎么设置：
加样的时候除了DNA，其他都需要加，包括引物，酶试剂，和DNA的溶剂（水或TE）才能算阴性对照
4 阳性对照怎么设置：
如果有清楚的父母本或之前分型成功的样本可以做阳性对照。一般情况下，如果群体样本里有多态性，在96孔以上的反应体系里，会自动聚类分型，可以不用阳性对照
5 为什么我的图像只有折现，没有聚类图：
再分型界面里选相关的分析选项Allelic选项
6荧光大部分还在阴性对照附近
这种情况是，循环数不够，或酶效率不高，或DNA质量不好引起反向效率不够。尝试加循环
7某些荧光值异常高，大部分还在阴性对照附近
这种情况是，是读板仪器污染后某些孔污染异常，忽略或OMIT这些孔位，重新分析
第一次操作需要注意什么：
阳性质控样本复孔
DNA浓度
第一次测试，后续不敏感
叶片DNA稀释10倍上机。
我的机器适合做flu-arms吗>
Thermo/ABI: QS3，QS5/6/7,7500, 7900，Vii7(stepone,7300请咨询公司)
Biorad：CFX96，CFX connect，CFX384，IQ5
罗氏：L480,L480II
LGC：iquant，道格拉斯，OMGEA F，SNPline
天隆：TL988VI，E96